Per Ardua ad Astra

Tanto gilipollas y tan pocas balas

El himno de la PCR

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Para todos los que alguna vez hemos pasado tardes enteras en el laboratorio, trasteando con micropipetas y detectando traslocaciones genéticas, aquí os presento el himno de la PCR.

Y, para los que no lo hayáis hecho, primero escucháis la canción, y luego la explico.

The PCR Song


There was a time when to amplify DNA,
you had to grow tons and tons of tiny cells.
Then along came a guy named Dr. Kary Mullis,
said you can amplify in vitro just as well.
Just mix your template with a buffer and some primers,
nucleotides and polymerases, too.
Denaturing, annealing, and extending.
Well, it’s amazing what heating and cooling and heating will do.

PCR, when you need to detect mutations.
PCR, when you need to recombine.
PCR, when you need to find out who the daddy is.
PCR, when you need to solve a crime.
(repeat)

Explicación para los que anden escasos de tiempo

La PCR es una técnica de biología molecular mediante la cual se puede amplificar (“fotocopiar”) una muestra de material genético. Con esto podemos, por ejemplo, hacer una electroforesis (correr la muestra en un gel de agarosa, en función de su carga y su tamaño), para ver algunas de sus características. Hoy en día, la PCR es una herramienta básica de trabajo en los laboratorios de investigación, empleándose también en el diagnóstico de algunas enfermedades.

Explicación ampliada

Como la canción está bastante bien, mejor la explico verso a verso. Los cuatro primeros describen cómo se obtenían grandes muestras de ADN antiguamente: lo que se debía hacer era cultivar las células para, después, triturarlas y procesarlas, obteniendo así ínfimas cantidades de ADN. ¿Problemas? Pues que necesitábamos células viables (no servían fragmentos ni células muertas), que pudiesen reproducirse, y que nosotros conociésemos cuáles eran las condiciones requeridas para ello (y que pudiésemos proporcionárselas, claro). Por poner un ejemplo práctico: una muestra de semen no nos serviría para nada.

Sin embargo, Kary Mullis describió en 1983 la técnica de la PCR o Reacción en Cadena de la Polimerasa. Esta técnica consiste en imitar, a gran escala, el proceso de copiado de ADN que tiene lugar en nuestras células. Para hacerlo en el laboratorio necesitamos, básicamente, una muestra de ADN a amplificar (basta con que haya ADN, no hace falta que sean células ni fragmentos), una enzima (la ADN polimerasa) que haga las copias, y materia prima para que esta enzima pueda funcionar.

Primero introduciremos nuestra muestra en un buffer, un medio con un tampón que proporciona las características de pH e iones apropiadas. Después, las enzimas encargadas de copiar las cadenas de ADN: una polimerasa (si la memoria no me falla, la que nosotros usábamos era la Taq-poli, de la bacteria Thermus aquaticus). Lógicamente, para que esta enzima pudiese hacer copias de la cadena de ADN, tambión necesitaba que añadiésemos los “eslabones” de la cadena: nucleótidos. Y, por último, un detalle bioquímico: la polimerasa no podía empezar a sintetizar porque sí, sino que necesitaba un cebador (primer), una secuencia de ADN a la que amarrarse.

Mezclamos todo esto en unos tubitos de 500 μL de capacidad, y lo introducimos en una máquina, un termociclador (el bicho que le pasan al negro de la primera fila en el vídeo). Y empieza el proceso. Inicialmente se calienta la muestra a unos 95ºC para desnaturalizar las cadenas de ADN. Como sabéis, el ADN está formado por una doble cadena de nucleótidos, complementaria una a la otra; pues bien, calentándolo a esta temperatura, separamos ambas cadenas, sirviendo cada una de molde para la copia de otra nueva.

Después llega el annealing, es decir, la unión del primer (o cebador) a la cadena, para que actúe como “semilla” de la síntesis de ADN. Así, bajando la temperatura de la muestra a unos 60 ºC de temperatura, el primer se unirá a una secuencia de nucleótidos complementaria a la suya. Ya os podéis imaginar la utilidad que este tiene esto: yo no quiero “fotocopiar” todo el material genético, sino sólo un gen determinado. Para ello añado un cebador cuya secuencia sea complementaria a una parte de la del gen, para que se enganche ahí y sea donde empiece la copia.

Y, por último, la extensión (extending) de la cadena: volvemos a calentar a ~72 ºC, que es la temperatura activa de la polimerasa, y esta enzima hace su trabajo, tomando nucleótidos del medio y añadiéndolos a la cadena, alargándola. Así, obtenemos dos cadenas complementarias a las otras dos originales: es decir, dos dobles hélices de ADN completas.

Hecho esto, lo único que queda es repetir los pasos un número n de veces, para obtener 2n copias del material genético. Y para ello, en vez de tener a un becario calentando y enfriando el baño María, hay una máquina que lo hace de manera automática: el termociclador del que hablaba antes. Esta máquina repite lo de “heating and cooling and heating” tantas veces y como nosotros le programemos. Vamos, como una Thermomix, pero en más sofisticado y más caro.

Ya hemos terminado la PCR. Ahora tenemos todas esas “fotocopias” del ADN para trabajar con él tranquilamente; por ejemplo, corriéndolo en un gel de agarosa (o de acrilamida, para mayor precisión).

¿Y esto de la corrida, de qué va?

Bueno, creo que esta entrada ya es suficientemente larga, así que mejor lo dejamos para otro día. Ahora es el momento de que los biólogos que leen este blog me tiren de las orejas por los fallos cometidos. Y, como digo siempre: espero que se haya entendido. Si me he explicado mal o hay algo que no ha quedado claro, no tenéis más que decirlo.

Perpetrado por EC-JPR

junio 23rd, 2008 a las 11:49 am

Categoría: Informática, Medicina